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Nel particolare mondo di Afro Samurai, costruito sul modello del Giappone feudale ma inserito in un contesto alternativo, dove tecnologia moderna si mischia ad architettura e costumi medievali (una sorta di steampunk a sfondo nipponico), i combattimenti sono all'ordine del giorno, e si susseguono incessanti tra coloro che aspirano al dominio.

Oggetto del desiderio sono in particolare due fascette, che si dice siano dotate di poteri divini, e che sono destinate al "Numero Uno" e al "Numero Due". Il primo è colui che di fatto domina il mondo, mentre il secondo è il suo pretendente diretto. Per diventare numero uno è necessario possedere prima la fascetta del numero due, poiché solo quest'ultimo può sfidare ed eventualmente uccidere il dominatore, prendendone il posto. Ne risulta una lotta continua per il potere, in particolare per chi è nella posizione di numero due, visto che di fatto è sfidato da chiunque abbia intenzione di salire in questa particolare scala sociale.

Afro, così chiamato per via del tipico capello alla Hendrix, ha assistito da piccolo all'uccisione del padre, all'epoca numero uno, da parte di un combattente chiamato Justice. Da quel momento è iniziato il suo percorso verso la vendetta, che passa ovviamente attraverso la conquista della fascetta da numero due fino allo scontro finale col numero uno. In mezzo, una lunga serie di combattimenti costellano la movimentata vita di Afro, il cui piglio impassibile, quasi apatico, denota la sua incrollabile decisione ad ottenere vendetta per la decapitazione del proprio padre.

La trama del gioco rappresenta una sorta di sunto della sceneggiatura originale da cui si discosta con alcune variazioni, mettendo in scena la caccia di Afro nei confronti di Justice inframmezzata dai combattimenti con il clan degli "Empty Seven" costantemente in lotta con il protagonista, dalla storia romantica con l'assassina Okiku e dai vari incontri con gli altri personaggi che si frappongono sul cammino. La storia viene narrata principalmente attraverso cutscenes e dialoghi spesso piuttosto criptici, che da una parte aumentano il fascino generale del gioco, dall'altra possono rendere difficile la comprensione della trama da parte di coloro che non conoscono il manga originale. 

la sceneggiatura è notevole, con dialoghi spesso brillanti e decisamente adulti, sia per il colorito linguaggio adottato, sia per il loro essere tutt'altro che banali, con frequenti introspezioni psicologiche che contrastano con le battute e il tono fortemente canzonatorio dell'alter ego del protagonista. 

Quest'ultimo, chiamato Ninja Ninja e doppiato da Samuel Jackson, è una sorta di coscienza di Afro dalla personalità allegra e sfacciata, opposta al carattere taciturno e oscuro del protagonista, che ci accompagna per tutto il gioco e che di fatto rappresenta una sorta di narratore e commentatore di tutta la storia.